关键词:
丙酮酸激酶M2
程序性死亡配体1
食管鳞状细胞癌
摘要:
目的探讨丙酮酸激酶M2(Pyruvate kinase M2,PKM2)的K367M、R399E不同突变位点对免疫检查点程序性死亡配体1(Programmed death-ligand 1,PD-L1)、程序性死亡配体2(Programmed death-ligand 2,PD-L2)及炎症因子白细胞介素-1α(Interleukin-1α,IL-1α)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)表达的调控作用,分析其在食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)免疫逃逸及肿瘤免疫微环境重塑中的潜在机制。方法构建KYSE150细胞稳定表达PKM2野生型(PKM2-WT)、PKM2-K367M和PKM2-R399E突变体,以及AKR细胞稳定敲低PKM2(shRNA-PKM2-1、shRNA-PKM2-2)的细胞模型。采用定量磷蛋白组学技术分析PKM2-WT与PKM2-K367M和PKM2-R399E之间的差异磷酸化蛋白。通过流式细胞术验证PKM2-K367M和PKM2-R399E突变体在KYSE150细胞中的表达稳定性,并检测PD-L1、PD-L2、IL-1α和IL-1β的表达水平。采用蛋白免疫印迹法检测表达PKM2-K367M或PKM2-R399E突变体的KYSE150细胞以及shRNA-PKM2-1、shRNA-PKM2-2的AKR细胞中PKM2、PD-L1、PD-L2和IL-1α的蛋白表达。将AKR对照细胞及shRNA-PKM2-1敲低细胞皮下接种C57BL/6N小鼠,每组3只,建立移植瘤模型,测量肿瘤体积和重量,通过免疫组化检测肿瘤组织中PKM2、Ki-67、PD-L1和PD-L2的表达。结果构建稳定表达PKM2野生型(PKM2-WT)、PKM2-K367M及PKM2-R399E突变体的人食管鳞癌KYSE150细胞株,以及稳定敲低PKM2的鼠源AKR细胞株。与PKM2-WT组相比,PKM2-R399E组IL-1α上调,PKM2-K367M和PKM2-R399E组普列克底物蛋白和Sec7结构域蛋白3(PSD3)上调,PD-L1、PD-L2、IL-1α和IL-1β的表达均升高(P<0.05)。与Control组比较,shRNA-PKM2-1、shRNA-PKM2-2组AKR细胞中PKM2、PD-L1、PD-L2、IL-1α的蛋白表达均降低(P<0.05)。体内实验中,与Control组比较,shRNA-PKM2-1组肿瘤重量降低,细胞质中PD-L1、PD-L2及细胞核中Ki-67的表达均降低(P<0.05)。结论PKM2不同突变位点可通过差异性调控PD-L1、PD-L2及IL-1α、IL-1β的表达,并伴有PSD3上调,提示PKM2通过免疫-代谢机制参与ESCC免疫检查点调控及肿瘤免疫微环境重塑。