关键词:
葛根素
细胞焦亡
结直肠癌
血管生成
增殖
转移
摘要:
为了探究葛根素对结直肠癌(colorectal cancer,CRC)细胞焦亡和恶性生物学行为的影响及可能的分子机制,使用培养CRC细胞系SW480和HCT116进行实验,分组情况为空白组(DMSO)、低浓度葛根素组(10μmol/mL)、中浓度葛根素组(50μmol/mL)和高浓度葛根素组(100μmol/mL),依据分组条件使用对应浓度的葛根素培养细胞。通过EdU增殖实验和克隆形成实验检测SW480和HCT116细胞增殖活性,划痕实验检测各组细胞迁移活性,Transwell实验检测各组细胞侵袭活性。通过Western blot和细胞免疫荧光实验检测各组细胞焦亡相关蛋白核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)、消皮素D(gasdermin D,GSDMD)、N-消皮素D(N-gasdermin D,N-GSDMD)、半胱氨酸蛋白酶1(caspase-1)和裂解半胱氨酸蛋白酶1(cleaved caspase-1)的表达情况;通过免疫荧光实验检测各组细胞焦亡相关蛋白NLRP3、N-GSDMD、cleaved caspase-1表达水平;ELISA试剂盒检测各组细胞培养上清中白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)的水平。将各组细胞培养上清加入人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)培养体系进行共培养,通过管形成实验检测HUVECs细胞血管生成能力,Western blot检测SW480细胞兔抗血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、血管内皮细胞钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-cadherin)表达水平。加入NLRP3抑制剂INF195进行回复实验。EdU实验、克隆形成实验、划痕实验结果均证明,葛根素以浓度依赖性方式抑制SW480和HCT116细胞增殖、迁移和侵袭活性。Transwell实验证明,葛根素以浓度依赖方式抑制HCT116细胞活力;与空白组相比,不同浓度葛根素组SW480和HCT116细胞内NLRP3、N-GSDMD和cleaved caspase-1蛋白表达水平均显著升高,GSDMD和caspase-1蛋白水平均显著降低;不同浓度葛根素组SW480细胞中免疫荧光NLRP3、N-GSDMD、cleaved-caspase-1表达均增加;不同浓度葛根素组HCT116细胞中NLRP3和caspase-1在免疫荧光中表达均上升;ELISA实验结果证明,上清中SW480和HCT116细胞中IL-1β和IL-18水平均显著升高。在共培养实验中,加入葛根素组细胞培养上清导致HUVECs细胞管形成能力显著下降,具体表现为与空白组相比,总管长和支点数量均显著下降;同时,HUVECs细胞内VEGFA、VE-cadherin蛋白表达水平显著降低。在回复实验中,Western blot实验表明,葛根素显著促进INF195诱导的SW480细胞NLRP3、GSDMD、N-GSDMD、caspase-1、cleaved caspase-1蛋白表达下降,且以浓度依赖形式进行;EdU实验结果显示,加入INF195后SW480细胞增殖活性以浓度依赖形式得到显著提高。划痕实验实验结果表明,INF195显著提高了SW480细胞的迁移、侵袭能力。具体来说,与没有加入INF195组相比,加入INF195后,细胞迁移速率显著下降(P<0.001、P<0.01、P<0.05);管形成实验中,与加入不含INF195的SW480细胞培养上清进行共培养的HUVECs细胞相比,加入了含INF195的SW480细胞培养上清的HUVECs细胞形成的血管总长度和支点数量均显著增加,同时VEGFA、VE-cadherin蛋白表达水平均显著升高。综合上述实验结果得出结论:葛根素能够显著抑制CRC细胞增殖、转移和肿瘤血管生成,并且与其促进NLRP3介导的细胞焦亡相关。