关键词:
骨肉瘤
白介素1β
细胞增殖
核因子κB
摘要:
目的解析骨肉瘤组织中白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的表达特征,揭示其表达水平与患者临床预后的关联性,并阐明IL-1β在调控骨肉瘤细胞增殖中的核心分子机制。方法收集2020年12月至2024年1月陆军军医大学第二附属医院骨科收治的4例骨肉瘤患者的肿瘤及癌旁组织,通过免疫组化、实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)和Western blot检测IL-1β的mRNA和蛋白表达差异;另收集2018年3月至2021年8月期间15例骨肉瘤石蜡标本,经免疫组化染色及Image J软件评分后分为IL-1β高表达组(3+、2+)和低表达组(1+、0);采用Kaplan-Meier法分析评分高低与患者生存率的关联。在体外实验中,以0~100 ng/mL IL-1β重组蛋白处理骨肉瘤细胞系U2OS后,通过EdU掺入、流式细胞术、CCK-8实验及单克隆形成实验筛选最佳增殖刺激浓度;对40 ng/mL IL-1β重组蛋白处理和未处理的U2OS细胞进行转录组测序,分析重组蛋白处理调控U2OS增殖的显著上调信号,并结合RT-qPCR、Western blot、免疫荧光染色验证关键调控分子核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)。通过慢病毒转染敲低IL-1受体1(interleukin-1 receptor type 1,IL-1R1);或者以NF-κB抑制剂恩贝林(embelin)处理后,采用EdU掺入实验、流式细胞术、CCK-8实验和单克隆形成实验检测各组细胞增殖变化。体内实验:将12只5周龄雌性裸鼠随机分为3组:对照组、IL-1R1敲低组和IL-1R1抑制剂(阿那白滞素)注射组,每组4只,采用胫骨髓内注射原位骨肉瘤模型,比较各组肿瘤生长情况。结果免疫组化染色和生存分析表明,IL-1β高表达骨肉瘤患者的临床预后较差(P<0.05)。体外细胞实验表明,与未处理组相比,IL-1β处理可显著提高骨肉瘤细胞系U2OS的EdU掺入比例(P<0.05)、增加细胞周期G2/M期占比(P<0.05)、提高单克隆形成能力(P<0.05),表明IL-1β可上调骨肉瘤细胞增殖能力。分析转录组数据表明,IL-1β处理与未处理组之间共存在4165个差异表达基因,包括1688个上调表达基因和2477个下调表达基因;IL-1β可显著上调U2OS中细胞周期和NF-κB信号通路。RT-qPCR结果表明IL-1β处理可显著上调细胞周期相关分子在mRNA水平的表达,该结果在蛋白水平上得到进一步证实。敲低IL-1R1后,与敲低对照组比较,U2OS的增殖能力明显下降(P<0.05),且RT-qPCR和Western blot数据均证实敲低IL-1R1降低了细胞周期相关蛋白和NF-κB的表达水平。Embelin的加入能够显著抑制IL-1β诱导的U2OS细胞中EdU掺入比例(P<0.05)、细胞周期G2/M期占比(P<0.01)和单克隆形成能力(P<0.05),同时抑制细胞周期相关蛋白的表达。动物实验结果表明,敲低IL-1R1组[(0.75±0.10)g,P<0.05]和阿那白滞素注射组[(0.93±0.06)g,P<0.05]小鼠肿瘤质量显著低于对照组(1.46±0.09)g。结论临床上IL-1β的瘤内水平与骨肉瘤患者的不良预后呈正相关;IL-1β通过IL-1R1/NF-κB信号轴上调骨肉瘤细胞的增殖能力。